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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2016-10-01 - 2019-09-30

Archaeen sind eine der ältesten Lebensformen die auf der Erde existieren. Diese einzelligen Organismen leben oft in extremen Biotopen. Viele Vertreter der Archaeen besitzen die Fähigkeit bei sehr hohen Temperaturen (d.h. über 80 °C), sehr niedrigen oder hohen pH-Werten, hohen Salzkonzentrationen oder hohen Drücken zu leben. Da bei vielen Archaeen die Zellhülle nur aus einer sehr dünnen Fettschicht (Lipidmembran), die von einer kristallinen Proteinschicht umhüllt wird, besteht, stellt sich die Frage wie die Natur diese hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber extremen Umweltbedingungen bewerkstelligt. Das Projekt „Herstellung und Charakterisierung von künstlichen archaealen Zellhüllen und deren Bedeutung als Modellmembran“ beschäftigt sich mit der Isolierung der biologischen Bausteinen (Lipide und Proteine) und dem Nachbau künstlicher Zellhüllen daraus. Es soll die Frage geklärt werden wie die Selbstorganisation der Etherlipide und der Oberflächenproteine im Detail abläuft. Zudem geht das Projekt der Frage nach welche Eigenschaften der Biomoleküle selbst und deren Verankerung untereinander zu den makroskopischen Zellhüllen mit erstaunlicher Widerstandsfähigkeit gegenüber extremen Biotopbedingungen führen. Zu diesem Zweck werden erstmals ausgewählte Stämme von Archaeen im Bioreaktor gezüchtet und daraus die Grundbausteine, das sind Oberflächenproteine und Fette (sogenannte Etherlipide), isoliert. Zusätzlich können die Oberflächenproteine auch genetisch hergestellt und verändert werden. So können Ankergruppen in das Protein eingefügt werden um dann spezifisch an die Etherlipide binden zu können. Dies ist ein neuer Ansatz den noch keine Forschergruppe zuvor versucht hat. Durch Anwendung des Bauprinzips, das in der Natur zu beobachten ist, werden Schicht für Schicht die Zellhüllstruktur von Archaeen nachgebaut. Dabei wird jeder Schritt mittels modernsten mikroskopischen und Oberflächen-sensitiven Techniken verfolgt und analysiert werden. Es kommen dabei neben hochauflösender Licht- und Fluoreszenzmikroskopie auch ein Elektronen- und ein Rasterkraftmikroskop als bildgebende Methoden zum Einsatz. Als wichtigste Oberflächen-sensitive Methoden seien die Oberflächenplasmonenresonanz Spektroskopie und die Schwingquarzmikrowaage mit Dissipationsmessung genannt. Diese Methoden dienen zur Bestimmung der Morphologie, Schichtausbildung, Dicke (im Nanometerbereich) und Beschaffenheit der Schichten. Aus den Ergebnissen dieses Projektes können wertvolle Erkenntnisse bezüglich der Isolierung und vor allem der Selbstorganisation von Zellwandbausteinen gewonnen werden. Aus diesem Wissen heraus können Oberflächenbeschichtungen mit sehr spezifischen Eigenschaften (z.B. antihaftend oder selbst-reinigend) hergestellt werden. Als weitere Einsatzgebiete sind biomimetische Membransysteme zu nennen, mit denen man die Zellwände der Archaeen studieren und modellieren kann. Letztere haben aber auch ein großes Potential um als Modellsysteme zu dienen, in denen man Membran-aktive Peptide und Membranproteine einbauen und systematisch untersuchen kann. Damit könnte es auch möglich sein hoch sensitive Diagnose- und Sensorsysteme zu entwickeln.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2015-01-01 - 2018-01-31

We propose developing a method of delivering a membrane protein to the cell membrane using electroporation instead of genetic manipulation. This method will combine and exploit three powerful technologies currently used in the field of synthetic biology: (i) in vitro membrane-assisted protein synthesis; (ii) the use of polymers in creating artificial membranes as scaffolds for protein folding and integration; (iii) the use of electroporation to fuse artificial membranes with cell membranes. Development of this technique will involve establishing protocols for electroporation, then tracing and understanding the fate of membrane proteins delivered to cell membranes using this method. Once the critical parameters have been identified and the method of their optimization established, we will deliver the dopamine receptor D2L to the membrane of P19 cells using electroporation. We will then ascertain if differentiation of P19 toward a neurogenic lineage results from this process. In addition, we will deliver two protein species in a mammalian cell line, one of which is the protein of the interest, DRD2, and the other a “tag”, targeting cell membranes. The tag protein would then be used for antibody staining and fluorescence-activated cell sorting.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2008-02-15 - 2013-02-14

Die Entschlüsselung vom Genom vieler Organismen hat gezeigt, dass ca. ein Drittel aller Genprodukte Membranproteine sind. Transmembran (TM) Proteine und periphere Proteine werden bei vielen Krankheiten angegriffen und sind daher bevorzugte Wirkungsstätten für Arzneien (mehr als 60% aller verschriebenen Medikamente wirken derzeit auf diese Proteine). Wegen der bedeutenden Funktionen der TM Proteine stellen Modellmembranen wichtige Systeme dar um fundamentale zelluläre Prozesse zu studieren und um Pathogene oder Wirkstoffe herauszufiltern. Im vorliegenden Projektantrag wird ein neuer Typ von festkörperunterstützten Membranen untersucht. Dabei wird der Festkörper (Sensor oder Elektrode) mit einem bakteriellen zweidimensionalen Proteinkristall (S-Schicht) überzogen und daran wird die Lipidmembran gebunden. S-Schicht unterstützte Lipidmembranen sind biomimetische Strukturen, die das supramolekulare Prinzip des Aufbaus der Zellwand von Archaea, die im Zuge der Evolution über Millionen von Jahren unter extremsten Bedingungen optimiert wurde, nachahmt. Für die Membranherstellung wird keine Apertur verwendet sondern kugel-, scheibchen- und zylinderförmige Lipidkonstrukte werden über elektrostatische oder spezifische Wechselwirkungen am S-Schichtgitter gebunden und fusioniert um planare Membranen herzustellen. Die S-Schicht dient dabei als stabilisierender Unterbau für Membranen bestehend aus Phospholipiden und Tetraetherlipiden oder Mischungen davon, Anbindungsstruktur, Abstandhalter zum Festkörper, als Ionenreservoir und, wenn sie als zweite Schicht auf der Membran aufgebracht wird, als nanoporöse Schutzschicht. Die S-Schicht unterstützten Lipidmembranen werden hinsichtlich ihrer strukturellen und dynamischen Eigenschaften, Langzeitstabilität und Fluidität in Abhängigkeit der Herstellungsmethode und Anbindungsstrategie charakterisiert werden. Durch Anwendung der S-Schicht Technologie ist zu erwarten, dass die Langzeitstabilität von fluiden Lipidmembranen wesentlich erhöht werden kann. Das große Ziel ist der Einbau von funktionellen Ryanodin Rezeptoren-Kalziumkanälen, nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und -Hämolysin. Diese TM Proteine wurden wegen ihrer klinischen Bedeutung, Verfügbarkeit von endogenen Liganden und Antikörpern, unterschiedlichen Membran-durchspannenden Strukturen und verfügbaren Literaturdaten ausgewählt. Es sind auch Einzelkanalmessungen für die in S-Schicht unterstützten Lipidmembranen eingebauten TM Proteine vorgesehen. Dieses Projekt wird Systeme zur Untersuchung von TM Proteine unter kontrollierbaren Bedingungen entwickeln. Dies ist nicht nur von großer Bedeutung im Bereich der Grundlagenforschung sondern auch für Screening-Verfahren nach Pathogenen oder Wirkstoffen und für die Entwicklung von auf TM Protein-basierenden Biosensoren.

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