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Research project (§ 26 & § 27)
Duration : 2016-10-01 - 2019-09-30

Archaea are one of the oldest life-forms existing on Earth. These unicellular organisms are often adapted to extreme habitats. Since the cell envelope of many archaea consists only of a very thin layer of fat (lipid membrane), into which an outermost crystalline protein layer is anchored, the question arises how Nature can accomplish this high resistance to extreme environmental conditions. The present project will study the reassembly of cell envelopes of archaea using previously isolated biological components, i.e., lipids and proteins. It aims to clarify the question how the self-organization of etherlipids and surface layer proteins proceeds in detail and which anchoring strategies are available for the formation of an artificial cell membrane. In addition, the question is addressed which properties of the biomolecules themselves and their assembly into macroscopic cell envelopes cause this amazing resistance to the extreme habitat conditions. Hence, selected archaea strains will be bred in the bioreactor and subsequently the basic building blocks will be isolated from the biomass. In addition, the surface layer proteins can also be genetically produced by host cells. This is a new approach, which has previously not attempted by another research group. By the application of Nature’s construction principle, the cell envelope structure of archaea will be reconstructed layer by layer. Each step will be tracked and analyzed using modern microscopial and surfaces-sensitive techniques. The results of this project will provide valuable insights into the isolation and in particular the self-assembly of cell envelope components. This knowledge can be applied to produce surface coatings with very specific properties. Further application are biomimetic membrane systems for studying the cell walls of archaea. The latter may also serve as model systems into which membrane-active peptides and membrane proteins can be incorporated and systematically investigated.
Research project (§ 26 & § 27)
Duration : 2015-01-01 - 2018-01-31

Gentransfektion einer Zelle um Fremdproteine herzustellen, ist eine übliche Methode. Im Resultat entsteht eine Zelle, die damit in der Lage sind, neue Funktionen zu erhalten, byw. neue Rollen in einem Gewebekontext einzunehmen. Es gibt zahlreiche Beispiele für diese Forschungrichtung, die durchaus schon seit Dekaden existieren. Die Methode der genetischen Manipulation von Zellen gibt es sowohl in transienter, als auch für stabile, permanenter Proteinherstellung in Zellen. These methods can broadly be described as stable or transient, depending on the fate of the genetic material. Grundsätzlich hängt es davon ab, welche Strategie yur genetischen Manipulation verwendet wird: Integration der kodierenden genetischen Information in das Genom einer Zelle, oder eben die Verwendung von Shuttlesystemen, die Plasmide. Die Regulation der Proteinherstellung in beiden Strategien ist nach wie vor extrem schwierig, was ein bekannter Nachteil in der Gentherapieforschung darstellt. In jedem Fall wird die Synthese eines fremde Gen typischerweise von einem mehr oder weniger starken Promotor kontrolliert, wodurch die biochemischen Resourcen einer Yelle stark strapaziert werden, bzw. Stressregulationsstoffwechselwege aktiviert werden. Resultat dieser Synthesestrategien ist oft eine begrenzte Lebensfähigkeit der proteinherstellenden Zellen – bis hin zum Zelltod. Ausserdem ist die Regulation der Verfügbarkeit Funktionalität-Aktivität der einzuschleusenden Proteine in lebende Zellen ein bisher bekanntes und grosses Problem für die Weiterentwicklung therapeutischer Strategien, die auf gentherapie basieren. Eine attraktive Alternative zu der Gentransfektion besteht darin, das gewünschte Membranprotein als fertiges Bauteil in eine Zelle hineinzubringen. Dayu soll im Rahmen dieses Antrages eine Architektur entwickelt werden, die ein funktionell gefaltetes Membraneprotein enthält. Das würde effektiv die Regulationsproblematik der hestellung eines Fremdproteines durch eine Gastzelle umgehen und – was noch viel bedeutender erscheint, die Notwendigkeit und Einschränkungen umgehen, wie eine Zelle die Existenz eines Proteins auf kotranslationaler Ebene kontrolliert. Verschiedene physikalische Methoden sind bereits entwickelt worden, um Membranproteine in Zellen hineinzubringen, wie Microinjektion, Osmotic shock und Trypsinisierungsmethoden. Eine für uns in diesem Kontext bekannte und interessante, da sehr präzise Methode stellt die Elektroporation dar. Damit moechten wir ‘intrazelluläre Implantate’ auf molekularer Ebene herstellen, indem wir solch membranstabilisierten, zellfrei hergestellten Membranproteine in die äussere Membran lebender Zellen hineinfusionieren. Für die Herstellung solcher Protein-Membranassemblies haben wir die zellfreie Synthese über die letzen zwanzig Jahre als Methode erfolgreich entwickelt. Sowohl in Phospholipidarchitekturen, wie vesikeln, als auch in Polymerarchitecturen, die aus amphiphilen Blockkopolymeren aufgebaut sind, koennen, wir in gegenwart von Ribosomen-Chaperonen und den entsprechenden Bausteinen, funktionsfähige Membranproteine herstellen. Damit hoffen wir, eine neue Strategie für die Herstellung von Membanproteinen angestossen zu haben, die es ermoeglicht, mit allen post und ko- translationalen Modifikationen, eine entprechende DNA in das jeweilige Membranprotein zu übersetzen und, im Rahmen dieses Antrages, diese Assemblies in lebende Zellmembranen via Elektroporation einzubetten.
Research project (§ 26 & § 27)
Duration : 2008-02-15 - 2013-02-14

Genome sequencing projects have revealed that membrane proteins represent about a third of the gene products in most organisms. Transmembrane (TM) proteins and membrane-associated proteins are targeted in many (infectious) diseases and thus, they are a preferred target for pharmaceuticals (currently more than 60% of all consumed drugs). Due to this important function, membrane models play an important part in unravelling the fundamental cellular processes involved and in screening for pathogens or drug candidates. In the present project lipid membranes anchored to a solid support which has previously been covered by a crystalline bacterial cell surface layer (S-layer) will be fabricated without the need of an aperture. These S-layer supported lipid membranes mimic the cell envelope structure of Archaea which dwell under very harsh conditions. Spherical, disc- and cylinder-shaped assemblies will be bound electrostatically or via specific interactions to many or few defined positions, respectively, on the S-layer lattice to form planar lipid membranes. The function of the S-layer lattice is manifold: stabilizing scaffoldings for the phospholipid bilayer and tetraetherlipid monolayer (and mixtures of the lipids), anchoring layer, spacer towards the solid support, ion reservoir, and as second layer on the top of the S-layer supported lipid membrane acting as an antifouling and nanoporous protecting layer. These S-layer supported lipid membranes differing in generation and anchoring strategy will be extensively characterized in terms of long-term stability and fluidity. Due to its planarity, a broad arsenal of techniques can be used to probe the structural and dynamic properties of these supported lipid membranes. The fluidity will be investigated by fluorescence microscopical and spectroscopical techniques. By applying the S-layer technology it is expected that the long-term robustness of fluid lipid membranes can be substantially increased. The final goal, however, is the reconstitution of functional skeletal muscle ryanodine receptor Ca2+ release channels, nicotinic acetylcholine receptors, and -hemolysin. These TM proteins have been chosen because of their clinical importance, availability of ligands, agonists and antagonists, antibodies, representing different membrane-spanning structures, and the accumulated knowledge in the literature. Single channel recordings are envisaged on all of these TM proteins reconstituted in S-layer supported lipid membranes. This project will develop systems where TM proteins can be studied under controlled conditions not only for basic research but also in screening for ligands, pathogens or drug candidates, agonists and antagonists, and the development of TM protein-based biosensors.

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